基本原理

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，zui后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行 定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA 可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有 3 種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體

②酶標(biāo)記的抗原或抗體

③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

注意事項(xiàng)

⒈正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA 等封閉。

⒉ 在 ELISA 中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括：

⑴ 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是 40孔聚苯乙烯 凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求 PH 在 9.0~9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也 有一定影響，一般多采用 4℃18~24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0 和 10 μg/ml 等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的 OD 值。選擇 OD 值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為 1~10 μg/ml.

⑶ 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接 ELISA 法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取「方陣法」（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

⑷ 酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如 OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條 件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如 TMB 和 ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間， 以 10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是 H2O2 在臨用前加入。